Chi tiết bài viết

PHÂN LẬP, PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN BHNA1 VÀ XÁC ĐỊNH GENE tfdA MÃ HÓA CHO ENZYME PHÂN HỦY 2,4-D TỪ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN THUỘC KHU VỰC TÂY NAM SÂN BAY BIÊN HÒA

Ngày đăng : 19/10/2012

Phùng Khắc Huy Chú1, Đào Thị Ngọc Ánh2, Lê Việt Hưng2, Đinh Thị Thu Hằng2, Đặng Thị Cẩm Hà2*

1-Viện Hóa học-Môi trường quân sự/BTL Hóa học; 2-Viện Công nghệ sinh học/VKH&CNVN

Từ khóa: 2,4-D, gene mã hóa enzyme TfdA, Pseudomonas, sân bay Biên Hòa

TÓM TẮT

       Năm 2007, trong hội đàm quân sự giữa Bộ Quốc phòng Việt Nam và Bộ Quốc phòng Mỹ, phía Mỹ đã cung cấp thêm các thông tin về các khu vực mà trong chiến tranh quân đội Mỹ đã sử dụng để tàng trữ, đóng nạp và phun rửa sau các chuyến bay phun rải chất độc hóa học da cam/dioxin tại một số sân bay quân sự ở miền Nam Việt Nam ngoài các khu vực đã biết tại sân bay Biên Hòa, sân bay Đà Nẵng, sân bay Phù Cát. Trong quá trình khảo sát để xác định thông tin do Bộ Quốc phòng Việt Nam tiến hành đã phát hiện thêm được một số khu vực ô nhiễm mới với mức độ ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin cao hơn mức cho phép theo tiêu chuẩn của Việt nam và thế giới (Kết quả bước đầu của dự án Điều tra đánh giá mức độ ô nhiễm dioxin tại 7 sân bay quân sự). Không chỉ dioxin mà các chất diệt cỏ như 2,4-D, 2,4,5-T và các chất trung gian của quá trình phân hủy sinh học tự nhiên khác cũng đã được phát hiện tại khu vực lấy mẫu để nghiên cứu.

         Chủng vi khuẩn BHNA1 được phân lập từ đất thuộc khu vực đầu Tây Nam sân bay Biên Hòa, đây là một khu vực mới được phát hiện trong năm 2008 và đến nay vẫn chưa xác định cụ thể nồng độ ô nhiễm, phạm vi ô nhiễm cũng như độ sâu lớp đất nhiễm. Khuẩn lạc chủng BHNA1 màu trắng đục, tròn, lồi nhẹ, đường kính khoảng 1,0-1,5 mm sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường muối khoáng chứa hỗn hợp dịch chiết từ đất của khu vực ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Tế bào chủng BHNA1 hình tròn ngắn, có kích thước 0,6 – 0,7µm x 1,2-1,7µm. Kết quả phân tích trình tự 16S rRNA cho thấy chủng này có quan hệ gần gũi với các chủng thuộc chi Pseudomonas sp như Pseudomonas aeruginosa DSM 50071; Pseudomonas indica IMT37; Pseudomonas resinovorans LMG 2274; Pseudomonas stutzeri ATCC 1758. Dựa trên các đặc điểm hình thái và trình tự gene16S rRNA, chủng BHNA1 được xếp vào chi Pseudomonas và được đặt tên là PseudomonasspBHNA1. Cặp mồi tfdAF, tfdAR được sử dụng để tách dòng đoạn genemã hóa 2,4-D/α-ketoglutarate dioxygenase từ DNA tổng số của chủng BHNA1, trình tự nucleotide của sản phẩm PCR nhân từ chủng BHNA1 cho thấy chủng này có mang đoạn gene tfdA mã hóa cho enzyme 2,4-D/α-ketoglutarate dioxygenase. Đoạn gene này có mức tương đồng từ 67-96% với gene chức năng tương tự đã được công bố. Tuy nhiên cần tiếp tục nghiên cứu các đặc tính sinh học khác và khả năng phân hủy 2,4-D và 2,4,5-T, các chất hữu cơ khó phân hủy khác của chủng vi khuẩn này.

       MỞ ĐẦU

       Tại một số “điểm nóng” ở Việt Nam, mức độ ô nhiễm chất diệt cỏ 2,4-D và 2,4,5-T chứa dioxin được quân đội Mỹ sử dụng trong chiến tranh là rất cao, gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho môi trường tự nhiên và con người. Hiện nay, bên cạnh một số khu vực đã xác định mức độ ô nhiễm (Văn phòng BCĐ 33, 2010), một số khu vực khác do phía Mỹ cung cấp là nơi từng lưu trữ, đóng nạp và phun rửa cũng đã được Bộ Quốc phòng Việt Nam xác định là khu vực ô nhiễm mới chất diệt cỏ/dioxin (Kết quả bước đầu của Dự án Điều tra đánh giá mức độ ô nhiễm dioxin tại 7 sân bay). Công tác xử lý, tẩy độc các điểm nóng ở Việt Nam đã được quan tâm và triển khai ở quy mô pilot cũng như quy mô hiện trường bằng công nghệ sinh học và thu được kết quả rất khả quan, sau 27 tháng xử lý 99,5 % tổng độ độc đã bị loại bỏ (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Đây là công nghệ có chi phí thấp, dễ thi công và đặc biệt ưu việt với môi trường bởi tính an toàn cũng như có thể xử lý triệt để nguồn ô nhiễm.

Các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam cho thấy có rất nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy không chỉ dioxin mà còn các chất diệt cỏ khác, đặc biệt là 2,4-D và 2,4,5-T. Con đường phân hủy sinh học 2,4-D đã được nghiên cứu khá kỹ. Đầu tiên 2,4-D được chuyển hóa thành 2,4-DCP và sau đó được oxy hóa đến 3,5-dichlocatechol. Con đường này được phát hiện trong các vi khuẩn Arthrobacter, Pseudomonas, Cupriadius, Flavobacterium, Acinetobacter, Halomonas và Variovorax vv. Bước đầu của con đường phân hủy 2,4-D bởiRalstonia eutropha JMP134 đã giả thiết là được thực hiện bởi 2,4-dichlorophenoxyacetate monooxygenase. Fukumori và đtg đã chỉ ra rằng enzyme này sử dụng α-ketoglutarate như là đồng cơ chất và được gọi là 2,4-dichlorophenoxyacetate/α-ketoglutarate dioxygenase (TfdA). Trong phản ứng này, α-ketoglutarate được chuyển hóa thành succinate và CO2, đồng thời với chuyển hóa 2,4-D đến glyoxylate và 2,4-DCP (Fukumori F el al.,1993).

Gene tfdA thuộc siêu họ gene của các enzyme phụ thuộc α-ketoaxit, chúng xúc tác oxy hóa các liên kết C-H mạch thẳng. Phản ứng chung được xúc tác bởi enzyme phụ thuộc α-ketoacid tham gia oxy hóa và tách nhóm carboxyl của đồng cơ chất α-ketoacid, đồng thời với sự oxy hóa của cơ chất. Trong quá trình chuyển hóa 2,4-D, một nguyên tử oxy được tham gia vào oxy hóa tách nhóm carboxyl của α-ketoglutarate, còn nguyên tử oxy khác được đưa vào chuỗi cabon β bên mạch thẳng để tạo ra chất trung gian không ổn định hemiacetal (hợp chất có kết nhóm C(OH)-(OR) là kết quả của phản ứng aldehyde và rượu) và được phân hủy đến glyoxylate và 2,4-DCP (Fukumori F el al.,1993).

Trong các công trình nghiên cứu trước đây (Nguyễn Bá Hữu, 2007, 2008) mới chỉ đề cập đến các vi sinh vật trong các bãi đất nhiễm tại các khu vực đã biết như Đà Nẵng. Hiện nay, những nghiên cứu về vi sinh vật tại khu vực Tây Nam sân bay Biên Hòa chưa được nghiên cứu. Để có các hiểu biết về vi sinh vật ở khu vực ô nhiễm mới được phát hiện này thì việc nghiên cứu sự có mặt của vi sinh vật, sự đa dạng về chủng loài và các gene chức năng tham gia phân hủy sinh học là rất cần thiết. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi đã tập trung phân lập các vi khuẩn có khả năng sinh trưởng, phát triển trên dịch chiết đất chứa dioxin và chất diệt cỏ như 2,4-D, 2,4,5-T, phân loại chủng đại diện và xác định gene tfdA. Các kết quả thu được cung cấp những hiểu biết về sự có mặt của vi sinh vật có khả năng phân hủy chất ô nhiễm và từ đó định hướng sử dụng phương pháp khử độc có hiệu quả nhất đối với khu vực mới phát hiện này.

       VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

       Phân lập vi khuẩn

       Cân 5 gam hỗn hợp đất với 1,25g đất/mẫu tại 4 vị trí lấy mẫu khác nhau ở độ sâu từ 0,7 đến 1,0m thuộc khu vực ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin phía Tây Nam sân bay Biên Hòa được sử dụng để phân lập vi khuẩn. Vi khuẩn được phân lập bằng phương pháp làm giàu sinh học trên môi trường muối khoáng với nguồn carbon là dịch chiết đất chứa dioxin, 2,4,5-T và 2,4-D (Nguyễn Bá Hữu, 2007).

       Xác định trình tự gene16S với cặp mồi 27F và 1492R

Genemã hóa 16S rRNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng kĩ thuật PCR với cặp mồi đa năng 27F (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) và 1492R (5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’). Sản phẩm PCR được xác định trình tự trên máy xác định trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3130x/Genetic Analyzer. Mức độ tương đồng của đoạn gene16S rRNA của chủng BHNA1 được so sánh với các trình tự gene 16S rRNA trong Genbank và Ribosom Database Project. Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự gene16S rRNA được thiết kế trên các phần mềm Clustal X, và Mega5.

       Xác định trình tự đoạn gene tfdA mã hóa cho enzyme phân hủy 2,4-D

       Cặp mồi tfdAF (5’-ACG GAG TTC TGY GAY ATG-3’) và tfdAR (5’-AAC GCA GCG RTT RTC CCA-3’) được sử dụng để nhân đoạn genetfdA mã hóa enzym phân hủy 2,4-D. Phản ứng PCR nhân đoạn genetfdAtừ chủng BHNA1 được thực hiện với thể tích 30µl gồm: 6µl đệm PCR 10mM/ml; 3,6µl MgCl2; 0,6µl dNTP; 0,15µl taq polymerase; 1µl DNA tổng số. PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: 95˚C: 4’, (95˚C: 1’, 52˚C: 1’, 72˚C: 1’) lặp lại 35 chu kì; 72˚C 8’. Sản phẩm PCR được bảo quản ở 4˚C và được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm bản gel với EtBr và quan sát dưới ánh sáng của đèn cực tím. Sản phẩm PCR được xác định trình tự trực tiếp. Xử lý, so sánh trình tự và dựng cây phát sinh loài dựa trên các phần mềm Clustal X, Mega5

       KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

       Phân lập và định loại vi khuẩn

       Năm chủng vi sinh vật được phân lập từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin có hình thái và kích thước khuẩn lạc khác nhau (Bảng 1).

       Bảng 1:Hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu đất khu Tây Nam, sân bay Biên Hòa.

TT

Tên chủng

Kích thước (mm)

Đặc tính

1

BHNA1

1 – 1,5

Tròn, trắng đục, trơn, bóng, lồi nhẹ

2

BHNB1

1,5 – 2,0

Tròn, trắng sữa, lồi nhẹ

3

BHNC1

< 1

Tròn, trắng đục, trơn, bóng

4

BHND1

1 - 2

Tròn, vòng hơi đen bên trong vòng trắng sữa, lồi cao

5

BHNE1

0,5 - 1

Tròn, trơn, bóng, trắng đục

DNA tổng số của các chủng trên được tách chiết làm sạch và sử dụng để nhân đoạn genetfdA. Kết quả thu được cho thấy chỉ có 2/5 chủng vi khuẩn là BHNA1 và BHNB1 có chứa đoạn gene này. Do đó, các nghiên cứu tiếp theo chỉ tập trung vào 2 chủng vi khuẩn trên và trong bài báo này chỉ đề cập đến chủng BHNA1.

Phân loại dựa trên hình thái và trình tự gene 16S rRNA chủng BHNA1

Hình thái:

       Chủng BHNA1 có khuẩn lạc tròn, trắng đục, trơn, bóng, lồi nhẹ kích thước 1-1,5 mm (Hình 1).




Hình 2: Hình thái tế bào vi khuẩn BHNA1 dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL

Dưới kính hiển vi điện tử quét tế bào hình que ngắn với kích thước 0,6 – 0,7µm x 1,2-1,7µm (Hình 2).

Trình tự gene 16S rRNA

Trình tự gene 16S rRNA của chủng BHNA1 được xác định trình tự và so sánh với một số chủng đại diện trên GenBank.


Khi so sánh trình tự gene 16S rRNA cho thấy chủng BHNA1 có quan hệ gần gũi với các đại diện  vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas. Trình tự của gene 16S rRNA ở chủng  BHNA1 có mức tương đồng là 96% so với Pseudomonas indica IMT37, 95% so với chủng Pseudomonas resinovorans LMG 2274 và Pseudomonas otitidis MCC10330. Tuy có quan hệ xa hơn với Pseudomonas stutzeri đã được biết đến với khả năng phân hủy carbazole/dioxin, đặc biệt là đồng phân 2,3,7,8-TCDD (Masaki Shintani, 2003).  Chi Pseudomonas cũng đã được phát hiện ở hầu hết các nghiên cứu  của Nguyễn Bá Hữu và đtg (Nguyễn Bá Hữu, 2007, 2008) khi tách chiết DNA thẳng từ các mẫu đất, hồ ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng.

Dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào và trình tự đoạn gene16S rRNA có thể sếp chủng BHNA1 vào chi Pseudomonas và đặt tên là Pseudomonas sp. BHNA1.

Kết quả phân lập và định tên vi khuẩn BHNA1 cho thấy đây là chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas sử dụng 2,4-D đầu tiên được phân lập từ đất khu vực ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin mới tại khu vực Tây Nam sân bay Biên Hòa.

       Trình tự đoạn gene tfdA

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng các vi khuẩn sử dụng 2,4-D thuộc các chi Achromobacter, Arthrobacter, Burkholderia, Corynebacterium, Delftra, Flavobacterium, Halomonas, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodoferans, Variovoranx, Bradyrhizobium và Sphingomonas (Vallaeys et. Al, 1997; Itoh et. Al 2004; Nguyen et. al 2007). Như đã biết bước đầu tiên của quá trình chuyển hóa sinh học 2,4-D thành 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP) được xúc tác bởi 2,4-D/α-ketoglutarate dioxygenase (TfdA). Enzyme này được mã hóa bởi gene tfdA trong các vi khuẩn thuộc β, γ-Proteobacteria và tfdAα trong các vi khuẩn thuộc α-Proteobacteria (Itoh et al, 2004). Do đó nghiên cứu này đã tập trung xác định được trình tự của gene tfdA từ chủng BHNA1 phân lập được từ Tây Nam sân bay Biên Hòa- là khu mới được phát hiện nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Sự tương đồng của gene tfdA ở chủng BHNA1 so với các gene khác từ các vi sinh vật được phân lập từ các nguồn ô nhiễm tương tự giúp cho chúng ta hiểu sâu sắc hơn về khả năng loại bỏ chất diệt cỏ của vi khuẩn này.

Hình 4: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene tfdA với cặp mồi tfdAF và tfdAR

Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gene tfdA với cặp mồi tfdAF và tfdAR có kích thước khoảng 357 bp phù hợp với tính toán lý thuyết. Loài vi khuẩn phân hủy 2,4-D được nghiên cứu nhiều nhất là Ralstonia eutrophaJMP134. Cơ chế chuyển hóa 2,4-D bởi vi khuẩn này thành 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP) nhờ enzyme TfdA mã hóa bởi gene tfdA và là bước đầu tiên trong quá trình phân hủy sinh học 2,4-D để nối tiếp cơ chế phân hủy để cuối cùng dẫn đến khoáng hóa chất độc này (Travkin et al,.1997; Itoh et al,. 2004).

Các nhà khoa học cũng đã phát hiện khả năng chuyển hóa 2,4-D của một loài thuộc chi Sphingomonastrong α-Protebacteria. Các genetham gia phân hủy 2,4-D trong nhóm này như tfdBC giống như ở loài R.eutropha JMP134, tuy nhiên bước đầu của quá trình oxy hóa 2,4-D không phải enzyme TfdA thực hiện mà là hệ thống enzyme khác (Itoh et al., 2004). Trong một số nghiên cứu cũng chỉ ra khả năng phân hủy carbazole của chủng vi khuẩn Pseudomonas resinovorans CA10 thực hiện bởi enzyme được mã hóa bởicatRcatBCA bằng con đường cắt nhân benzene (hay nhân thơm) ở vị trí ortho (Hideaki Nojiri et al,. 2001). Các nhà khoa học Ấn Độ (Om Prakash et al,. 2007) cũng đã chứng minh khả năng phân hủy phenanthrene của chủng Pseudomonas delhiensis RLD-1 được phân lập từ than tro bay của nhà máy nhiệt điện tại Delhi. Một nhóm nhà khoa học khác cũng chứng mình khả năng phân hủy butan, các hydrocarbon mạch thẳng cũng như p-hydroxybenzoate hay protocachuate của Pseudomonas indica  IMT37 và IMT40 (K. K. Pandey et al,. 2002). Vậy chủng Pseudomonas có chứa gene tfdA không?và độ tương đồng với các gene trong các loài vi khuẩn Pseudomonas và các vi khuẩn khác nhau ở điểm nào đã được nghiên cứu?

Kết quả ở hình 4 cho thấy sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa tfdA từ DNA tổng số của chủng BHNA1 có kích thước như tính toán, lý thuyết. Sản phẩm PCR nhân đoạn genemã hóa cho enzyme TfdA từ chủng BHNA1 được làm sạch và xác định trình tự trực tiếp. Trình tự của đoạn gene chức năng này trình bày ở hình 5

CT AAG GCA TTA TCT AGT TAC TCT GTC GTT GCC GGT ACA CGA ACT GGG GCT

    K   A   L   S   S   Y   S   V   V   A   G   T   R   T   G   A

GCG TGG CGA GGC CAT GAG TTC ATC GAT CAG TTC GCG GCT TTC GTC ATC ATC

 A   W   R   G   H   E   F   I   D   Q   F   A   A   F   V   I   I

CAT GCC TTC TAT GCG GCT GAT GTG CGA TGC GAT GTA GAG GGA TCG GCG GCC

 H   A   F   Y   A   A   D   V   R   C   D   V   E   G   S   A   A

GGT GCC TGC ATG CCG GCG CAC GAG GAC TTG CCG CAC GGG CGG CTG GAG CTC

 G   A   C   M   P   A   H   E   D   L   P   H   G   R   L   E   L

GCG CCA GGC GTC AGG CAC CGA ACC CAC GTC GAA ATC CGT CAG TCC GCG CGA

 A   P   G   V   R   H   R   T   H   V   E   I   R   Q   S   A   R

GTG AAA GTA GTC ATG CAC CGC GAT CAA CGG AGC CAG GCG TTG CCG CCG TTC

 V   K   V   V   M   H   R   D   Q   R   S   Q   A   L   P   P   F

TTC GCC CAG GGC GTC CCA GGC CGC CCG CAT GTC GCC GAA CTC CGT TA

 F   A   Q   G   V   P   G   R   P   H   V   A   E   L   R

Hình 5:Trình tự nucleotide đoạn gene mã hóa enzyme TfdA và trình tự amino acide suy diễn nhân lên từ DNA chủng Pseudomonas sp.BHNA1với cặp mồi tfdAF, tfdAR

       Kết quả ở hình 6 cho thấy trình tự của gene tfdA thu được gần gũi nhất với gene tfdA của dòng 5-13 đây là chủng vi khuẩn được phân lập không thông qua nuôi cấy từ mẫu đất nông nghiệp sau khi cho phơi nhiễm với mecoprop (đây là một loại chất diệt cỏ hay được các hộ gia đình sử dụng để ngăn ngừa sự phát triển sự ra lá của cỏ) (Gazitua MC et al,.2010) với độ tương đồng 115/167 nucleotide so sánh. Theo nghiên cứu của Adrienne Zaprasis và đtg (2010) có trình bày về genetfdA trong đất có liên quan đến Bradyrhizobium spp nhóm 2 và 3, Sphingomonas spp và vi khuẩn đất không nuôi cấy có khả năng phân hủy chất diệt cỏ phenoxyalkanoic acid (PAA) được phân lập từ đất nông nghiệp hoặc đất rừng của vùng Klostergut Scheyern, CHLB Đức.



Nói chung sự tương đồng của gene tfdA của chủng BHNA1 so với các chủng đã biết không cao trong khoảng từ 67 đến 89% nhưng tất cả các chủng vi khuẩn trên đều phân lập được từ đất nhiễm chất đa vòng thơm và đều có khả năng phân hủy các chất diệt cỏ. Theo nghiên cứu của Hogan và đtg (1997) khi sử dụng kỹ thuật PCR để điều tra sự phân bố của gene tfdA trong đất đã không phát hiện thấy các  vi khuẩn phân hủy 2,4-D. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng 37% trong số 76 vi khuẩn (tương ứng khoảng 28 vi khuẩn) có mang gene tfdA và không có chủng nào trong số này có khả năng phân hủy 2,4-D. Minh chứng này cho thấy có những vi khuẩn chứa gene tfdA nhưng chưa chắc tham gia mã hóa enzyme phân hủy 2,4-D. Các tác giả đã giả thiết rằng, gene tfdA hoặc các gene có mức tương đồng cao phân bố rộng rãi trong các vi khuẩn này có thể đóng vai trò khác chứ không phải phân hủy 2,4-D (Hogan et al.,1997). Như vậy kết quả thu nhận được của nghiên cứu này chỉ mới chứng minh được sự tồn tại của gene tfdA trong chủng BHNA1 cũng như có sự tương đồng nhất định về trình tự gene mã hóa này. Để đánh giá khả năng phân hủy các chất diệt cỏ chứa mạch vòng bởi vi khuẩn BHNA1 so với một số chủng vi khuẩn trong đất khác đã biết cần phải có thêm rất nhiều nghiên cứu bổ sung. Vì vậy, cần thiết kế các nghiên cứu tiếp theo để xác định khả năng phân hủy 2,4-D và các chất hữu cơ chứa clo khác có mặt trong đất nhiễm của khu Tây Nam sân bay Biên Hòa.

       KẾT LUẬN

       Đã phân lập được 5 chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng trên dịch chiết đất chứa dioxin, 2,4,5-T và 2,4-D như là nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Chủng vi khuẩn BHNA1 trong số vi khuẩn kể trên đã được phân loại và xác định gene chức năng tham gia bước đầu tiên cắt vòng thơm của 2,4-D.

       Chủng vi khuẩn BHNA1 phân lập được từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tai khu vực Tây Nam sân bay Biên Hòa thuộc chi Pseudomonas và được đặt tên là Pseudomonas spBHNA1.

       Đây là chủng vi khuẩn đầu tiên được phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại khu vực  mới được phát hiện ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin chứa gene tfdA mã hóa cho enzyme TfdA tham gia vào bước đầu tiên trong quá trình phân hủy 2,4-D.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

       De Lipthay JR, Barkay T, Sorensen SJ (2001) Enhenced degradation of phenoxyacetic acid in soil by horizonal transfer of the tfdA gene acoding a 2,4-dichlorophenoxyacetic dioxygenase. FEMS Microbiol Ecol 35: 75-84.

       Digiovanni GD, Neilson JW, Pepper II, Sinclair NA (1996) Gene transfer of Alcaligenes eutrophus JMP134 plasmid pJP4 to indigenous soil recipients. Appl Environ Microbiol 62(7): 25221-2526.

       Hogan DA, Buckley DH, Nakatsu CH, Schmidt TM, Hausinger RP (1997) Distribution of the tfdA gene in soil bacteria that do degrade 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Microbial Ecol 97: 90:96.

       Itoh K, Tashiro Y, Uobe K, Kamagata Y, Suyama K, Yamamoto H (2004) Root moduleBradyrhizobium spp. habour tfdAα and cadA, homologous with genes encoding 2,4-dichlorophenolxyacetic acid-degrading protein. Appl Environ Microbiol 70: 2110-2118.

       Kitagawa W, Takami S, Miyauchi K, Masai E, Kamagata Y, Tiedie JM, Fukuda M (2002) Novel 2,4-dichlorophenolxyacetic acid degradation  genes from oligotrophic Bradyrhizobium sp strain HW 13 isolated from a pristine environment. J Bacteriol 184: 509-518.

       Nguyen LH, Itoh K, Suyama K (2007) Diversity of 2,4-dichlorophenolxyacetic acid (2,4-D) and 2,4,5-trichlorophenolxyacetic acid (2,4,5-T)-degrading bacteria in Vietnamese soils. Microb Environ 22(3): 243:256.

       Hideaki Nojiri, Kana Malda, Hiroyo Sekiguchi, Masaaki Urata, Masaki Shintani, Takato Yoshida, Hiroshi Habe and Toshio Momori (2002) Organization and transcriptional characterization of catechol degradation genes involved in carbazole Degradation by Pseudomonas resinovorans strain CA10. Biosci Biotechnol Biochem, 66(4): 897-901.

       Om Prakash, Kirti Kumari and Ruplal (2007) Pseudomonas delhiensis sp. nov., from a fly ash dumping site of a thermal power plant. IJSE.Microbioly 57: 527-531.

       K.K. Pandey, S.Mayilraj and T. Chakrabarti (2002) Pseudomonas India sp. nov., a novel butane utilizing species. IJSE.Microbioly 52: 1559-1567.

       Gazitúa MCSlater AWMelo FGonzález B (2010), Novel α-ketoglutarate dioxygenase tfdA-related genes are found in soil DNA after exposure to phenoxyalkanoic herbicides.Environ Microbiol 12(9):2411-25.

       Adrienne Zaprasis, Ya-Jun Liu, Shuang-Jiang Liu, Harold L. Drake, and Marcus A. Horn, Abundance of Novel and Diverse tfdA -Like Genes, Encoding Putative Phenoxyalkanoic Acid Herbicide-Degrading Dioxygenases in Soil. Applied and environmental Microbiology, 2010, p. 119–128.

       Fukumori F, Hausinger RP (1993) Alcaligenes eutrophus JMP 134 “2,4-dichlorophenolxyacetate monooxygenase” is an α-ketoglutarate-dependent dioxygenase. J Bacteriol 175: 2083-2086.

       Masaki Shintani, Hideaki Nojiri, Takako Yoshida, Hiroshi Habe and Toshio Omori (2003),carbazole/dioxin degrading car gene cluster is located on the choromosome of Pseudomonas stutzeristrain OM1 in a form different from the simple transposition of Tn4676. Biotechnology letter 25: 1235-1261.

       Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2007) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của ba chủng vi khuẩn sử dụng 2,4-D phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại Đà Nẵng. Tạp chí Sinh học 29(4): 80-85.

       Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2008). Xác định các đoạn genemã hóa enzyme chuyển hóa chất diệt cỏ từ ba chủng vi khuẩn phân hủy dibenzofuran. Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(2): 257-264.

       Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2007) Xác định genemã hóa dioxygenase của chủng vi khuẩn Paenibacillus sp. Ao3 phân hủy dibenzofuran phân lập từ bùn ao thuộc khu đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại Đà Nẵng. Tạp chí Công nghệ sinh học 5(3): 391-396.

ISOLATIONCLASSIFICATION BACTERIUM BHNA1 AND DETERMINATION OF GENE tfdA CODING FOR  2,4-D DEGRADING ENZYMES  IN NEW HERBICIDES/DIOXIN CONTAMINATED AREA FROMSOUTH-WEST OF BIEN HOA FORMER MILITARY BASE

Phùng Khắc Huy Chú1, Đào Thị Ngọc Ánh2, Lê Việt Hưng2, Đinh Thị Thu Hằng2, Đặng Thị Cẩm Hà2*

1-Institude of Military Chemistry and Environment; 2-Institude of Biotechnology

SUMMARY

       Bacterial BHNA1 strain isolated from soil of the south-west area of Bien Hoa airbase. In 2008, contamination of soil and sediment by herbicides/dioxin was detected in different locations of this new area. However, the real toxicity has not yet been analyzed. Colony morphology of BHNA1 isolate was milky, round, slightly convex and achieved 1.0 to 1.5 mm in diameter after 3 days of culture in mineral salt medium containing extract of  heavy herbicide/dioxin soil. Bacterial cell were rod shaped with diameter ranging from 0.6 to 0.7 μm x 1.2 to 1.7μm. The sequence of 16S rRNA gene showed that this strain is closely related to representative of genus Pseudomonas such as Pseudomonas aeruginosa DSM 50071 spPseudomonasindica IMT37Pseudomonas resinovorans LMG 2274Pseudomonas stutzeri ATCC 17588Based oncharacteristics of morphology and 16S rRNA gene sequencestrain BHNA1 should be placed in genusPseudomonas and named Pseudomonas sp. BHNA1.  Five bacterial isolates are capable growing in mediumcontaining dioxin2,4,5-T and 2,4-D from soil extract as sole carbon and energy sourcesThis is the firststrain isolated from in new herbicides/dioxin contaminated area. The tfdA gene coding for enzyme 2,4-D/α-ketoglutarate dioxygenase (TfdA) involving in the initial step of upstream 2,4-D degradation was also identified.

Keyword: 2,4-D, gene coding enzyme TfdA, Pseudomonas, Bien Hoa Airbase.

(*): Author for correspondence: Tel: 84-4-38360892, Email: dangcha80@yahoo.com

Tags :